1. 서론

심혈관계 질환은 전 세계적 사망원인 1위, 국내 사망률 2위의 질병으로 현재에도 주요 사망원인으로 작용한다. 관상동맥질환이나 뇌졸중과 같은 질환들은 영양소와 세포를 전달하는 혈관이 다양한 원인으로 인해 좁아지게 되어 발생하는데, 이에 대한 조직공학적 치료적 접근 방법으로는 자가 조직이식, 인공혈관 이식, 스텐트를 사용한 혈관 우회로 형성이 주로 채택된다. 그 중 인공혈관 이식이나 혈관 스텐트를 제작하는 방법으로서 최근 3D 프린팅이 각광받고 있는데, 이는 3D 프린팅 기술의 적층 제조 방식과 환자 맞춤형 제작 가능성, 생체의학 분야에서의 응용 가능성에 기반한 것이다.

최근에는 더 나아가 살아있는 세포를 포함한 바이오잉크를 활용하여 사람의 장기를 직접 3D 프린팅할 수 있는 바이오프린팅 기술에 대한 관심이 높아지고 있다. 이렇게 바이오프린팅된 세포 지지체는 인공장기로 쓰일 수 있을 뿐만 아니라 동물실험을 대신해 신약이나 화장품을 평가할 수 있는 새로운 플랫폼으로 활용될 수 있어 미래에는 이러한 바이오프린팅 기술로 만들어진 세포 지지체가 각광받을 것으로 기대된다. 하지만 기존의 바이오프린팅 연구는 바이오잉크 소재의 한계로 혈관이 없는 단순한 인공조직만 만들 수 있거나, 바이오프린팅 기술의 한계로 제조된 인공장기의 크기가 작아 실제 조직처럼 기능하기에는 무리가 있었다.

이를 해결하기 위한 방안으로 최근 몇 년간 ‘자유형 3D 프린팅 (Freeform 3D printing)’ 방식이 그 독특한 인쇄 방식으로 인해 학계의 주목을 받고 있다 [1,2]. 자유형 3D 프린팅은 인쇄 재료와 지지 매트릭스라는 두 가지의 주요 구성 요소를 포함하며, 이로 인해 추가적인 지지체 없이도 3차원 상에서 직접 인쇄물을 구현할 수 있고, 지지체의 제거 이후에도 구조적 무결성과 기계적 안정성을 제공한다. 이러한 성질은 혈관처럼 굽은 형태와 더불어 불규칙성 및 가변성을 띠는 인체조직의 대체품을 제작하는 데에 적합하기 때문에, 자유형 3D 프린팅을 통해 복잡한 구조로 이루어지는 혈관의 구조를 효과적으로 제작할 수 있다. 따라서, 본 기고문에서는 조직공학적으로 혈관을 구현하기 위한 기존 3D 프린팅 기술과 혈관 구조를 가진 조직 제조를 위한 자유형 3D 프린팅 기술에 대해 소개하고자 한다. 또한 3D 프린팅 기술에 대한 앞으로의 전망에 대해 이야기 하고자 한다.

2. 혈관 구조 제조를 위한 3D 프린팅 기술

이미 쓰이고 있던 기존의 혈관 구조 3D 프린팅 기술으로는 1) 주형 프린팅 방식(Mold printing strategy) 2) 희생 물질프린팅 방식 

(Sacrificial material printing strategy) 3) 동축 압출 방식(Coaxial extrusion printing strategy) 4) 잉크젯 프린팅 방식(Inkjet printing strategy) 5) 광경화 기반 프린팅 방식 (Lithography-based printing strategy)이 있다. 주형 방식은 원하는 모양의 틀에 재료를 부어 3D 형태를 만드는 방식으로, 실제 혈관과 비슷한 구조를 제작하는 데에 적합하며 스캐닝 기술이 발달함에 따라 환자 개인에 맞춤화 된 혈관 조직을 제작할 수 있다. 희생 물질 방식에서는 제거하기 쉬운 희생 재료를 지지 매트릭스 역할로 사용하고, 이와 구분되는 제 2의 재료를 이용해 복잡한 3D 구조를 형성하는데, 다양한 물질을 활용할 수 있으며 영구적인 구조물을 형성하는 데에 널리 사용된다. 동축 압출 방식은 동축 상에 있는 노즐을 통해 압출되는 두 재료의 방출을 조절하여 3D 구조를 만드는 방식으로, 관형 구조를 설계하기 위한 손쉬운 접근 방식이며 이를 통해 다양한 직경의 관형 구조를 제작할 수 있다. 잉크젯 인쇄 방식은 세포가 포함된 바이오 잉크로 3D 구조를 프린팅 하는 방식으로, 세포의 개수나 종류에 상관없이 바이오 잉크 내의 균질한 세포 분포를 유지하며 높은 밀도의 세포를 담지시킬 수 있는 효율적인 방식이다. 광경화 기반 액체 기반 지지 재료 상에서 광경화성 합성 생체 고분자를 원하는 부분만 빛으로 경화시켜 3D 구조물을 제작하는 방식으로, 다른 3D 프린팅 방식보다 높은 공간 해상도를 제공하는 특징이 있다. 그 외에도 계면 확산 프린팅(interfacial diffusion printing)이나 전기수력학 잉크젯 프린팅(electrohydrodynamic inkjet printing) 기술 등으로 혈관을 구현하려는 노력들을 진행하고 있다.

그림 2. 혈관 구조 제조를 위한 다양한 3D 프린팅 기술 (a) 주형 프린팅 방식, (b) 희생 물질 프린팅 방식, (c) 동축 압출 방식, (d) 잉크젯프린팅 방식, (e) 광경화 기반 프린팅 방식.

3. 혈관 구조를 가진 인공 조직 제조를 위한 자유형 3D 프린팅 기술

앞서 소개한 기존의 3D 프린팅 기술들은 단순 혈관 구조만을 출력하는 데 그칠 뿐 아니라, 매우 복잡한 구조 생성을 요하는 혈관 구조물 제작에 있어서 지지 재료가 없어지면 자가 지지 구조가 결국 무너지게 된다는 치명적인 한계를 갖는다. 그에 따른 대책으로 등장한 것이 자유형 3D 프린팅 방식으로, 이를 응용하기 위한 다양한 세부 프린팅 방법들과 인쇄 재료에 대한 광범위한 연구가 이루어지고 있다.

자유형 3D 프린팅은 기존의 단순 적층 방식과 달리 인쇄용 잉크가 노즐을 통해 압출되면 젤라틴 등의 하이드로겔로 구성된 지지 매트릭스 내에서 실험자가 원하는 형상을 3차원 상으로 직접 구현할 수 있기에 기존 방식들에 비해 돌출 구조 등 보다 복잡한 형태도 원활하고 선명하게 제작할 수 있다. 또한, 만약 지지 매트릭스를 인쇄된 구조물로부터 분리한다고 해도 출력된 3차원 구조물이 붕괴나 변형 없이 원형을 유지하며 출력물이 스스로를 지탱할 수 있다는 장점이 있다.

자유형 3D 프린팅 방식은 다시 1) 재료 압출 기반형(Material extrusion-based) 2) 세포 함유 잉크 압출 기반형(Cellladen extrusion-

based) 3) 세포 구조 기반형 (Cell construct-based) 4) 광분해 기반형(Photodegradation-based) 5) 투영 광경화성 수지 조형 기반형 (Projection stereolithography-based) 의 다섯 가지로 나누어 설명할 수 있다.

3.1. 압출 기반 3D 프린팅 기술

재료 압출 기반 자유형 3D 프린팅 방식은 복잡한 3D 구조를 인쇄할 때 구조의 붕괴를 방지하는 지지 수조와 관류(Perfusion) 이후에 통로(channel)를 형성하는 생분해성 잉크로 구성된다. 본 방식에서는 세포가 함유된 배지가 세포 성장을 위해 인쇄된 재료 내부의 통로로 침투하며, 이러한 특성으로 인해 지지 수조 내에서 관류를 형성할 수 있는 잉크의 인쇄 가능성과 관류 이후 잔류 물질의 생체적합성이 주요 쟁점이다. 또한 이러한 방식에서는 젤라틴이나 젤라틴 변형 소재 기반 지지 수조가 앞서 언급한 본 프린팅 방식의 특성에 의해 종종 사용된다. 이러한 내용을 바탕으로Compaan 연구진은 가교 가능한 젤라틴-젤란 마이크로겔 수조를 제작 및 사용하는 연구를 진행했다. 본 연구에서 젤란과 젤라틴 마이크로겔은 각각 고체상의 매트릭스 수조를 형성하기 위해 유변학적으로 조절하는 데에 사용되는 젤라틴기반 전구체 상에서 제작되었다.

그림3. 혈관 구조를 가진 인공 조직 제조를 위한 압출 기반 3D 프린팅 기술 (a) 재료 압출 기반형 프린팅 방식, (b) 세포 함유 잉크 압출기반형 프린팅 방식, (c) 세포 구조 기반형 프린팅 방식.

세포 함유 잉크 압출 기반 자유형 3D 프린팅 방식은 재료 압출 기반형과 압출 방식은 같지만, 세포를 포함하는 바이오 잉크를 사용하기 때문에 세포의 생존력을 높이기 위해서는 잉크와 지지 수조를 이루는 재료들이 반드시 생체적합성을 띠어야 한다. 또한 압출 과정에서 잉크 내의 세포들에 스트레스가 가해지기 때문에 조심히 다뤄져야 하며, 이에 따라 본 방식에서는 잉크에 내장된 세포들의 생존력(생육력) 향상에 초점이 맞춰진다. Noor 연구진은 이 기법을 바탕으로 심근 세포(CMs; Cardiomyocytes)와 내피 세포(ECs; Endothelial Cells)에 대한 특정 분화 조건을 가진 유도 만능 줄기 세포(iPSCs; induced Pluripotent Stem Cells)를 사용해 복잡한 혈관 구조를 가지면서도 충분히 두껍고, 관류 형성이 가능한 개인 맞춤형 심장 스캐폴드(Cardiac scaffolds)를 생성하는 새로운 방법에 대해 보고했다. 해당 연구에서 인간 대망 조직 기질 세포 기반 iPSC로부터 CM 및 EC의 배양 · 인쇄 · 추출 과정 이후 특정 염색 방법을 통해 분화가 성공적으로 이뤄졌음을 확인할 수 있었으며, 그와 유사한 세포 생존력을 지닌 지지 수조 상에서 더 복잡한 모양을 형성하는 데에도 성공했다. 또한 쥐에 생체실험을 적용한 결과, 필요한 기능을 위해 특정하게 배치한 iPSC를 기반으로 한 심장 패치가 성공적으로 제작되어 실제 적용가능성까지 제시할 수 있었다.

재료 압출 기반형과 세포 함유 잉크 압출 기반형 방식이 다양한 물질을 사용해 지지 매트릭스와 잉크를 구성하는 데에 많은 발전을 가져왔지만, 여전히 잔류 고분자성 물질의 유해성이나 추가 가교제 사용 등에 대한 우려가 남아있다. 이에 따라 세포 구조 기반 자유형 3D 프린팅 방식이 개발되었다. 이러한 근래의 연구들은 세포의 생존력을 유지하기 위해 추가 매트릭스의 양이 크게 감소된 원본 재료로서 중간엽 줄기세포(MSCs; Mesenchymal Stem Cells)나 세포 오가노이드(cellular organoids)를 포함하는 세포 구성을 활용하는 데에 초점을 맞춰 왔다. 그 중에서도 Norotte 연구진은 특히MSC를 혈관 구조를 생성하는 원재료로서 활용하였는데, 해당 연구에서는 CHO(Chinese Hamster 

Ovary) cell과 HUVSMC(인간 제대 정맥 평활근 세포), HSF(인간 피부 섬유아세포)를 포함하는 세포 스페로이드의 제작과 프린팅을 통한 

scaffold-free 혈관 조직 공학 기술에 대해 소개하고 있다. 본문에서는 인쇄된 세포 스페로이드를 지지하기 위해 다당류 소재인 agarose 

rod가 사용되었다. 이 연구는 스캐폴드 없이 세포를 패턴화 시킴으로서 복잡한 개인 맞춤성 혈관 구조를 제작하는 방식의 가능성을 시사하고 있다.

3.2. 광경화 기반 3D 프린팅 기술 

그림 4. 혈관 구조를 가진 인공 조직 제조를 위한 광경화 기반 3D 프린팅 기술 (a) 광분해성 기반형 프린팅 방식, (b) 투영 광경화성 수지 조형 기반형 프린팅 방식.

고에너지성 레이저는 다양한 분야에서 개인화 된 패턴을 형성하기 위해 특정 물질을 선택적으로 깎아내는 데에 활용되어 왔다. 조직공학 학계에서도 부드러운 재료 내에 빈 공간을 형성하기 위해 레이저를 유용하게 활용하는 방안에 대해 주목해오고 있다. 또한 레이저는 조절에 의해 복잡한 형상을 제작할 수도 있으며, 이러한 특성을 이용한 방식이 광분해 기반 자유형 3D 프린팅 방식이다. 레이저를 사용하는 공제 방식에서 세포 독성 요소와 추가 공정이 없기에, 하이드로겔 내에서 자유형 혈관 구조를 제작하는 데에 이 방식을 사용하기 위한 연구가 수행되었다. 대표적으로 Applegate 연구진은 생체적합성 하이드로겔 내에서 3D 다중 규모 미세 패턴 구조를 형성하기 위해 레이저를 활용하는 내용을 발표했다. 본 연구에서는 고도로 투명한 엘라스토머성 SF(Silk Fibroin) 하이드로겔을 레이저의 초점 이동에 따라 내부의 빈공간을 유지할 수 있는 광분해성 하이드로겔로서 이용하며, 이에 빛의 다광자 흡착성(MPA; Multiphoton Adsoption)을 적용하였다. 비록 이 연구 상에서는 실크 하이드로겔 사용에만 초점이 맞춰졌지만, 광안정성 결합을 지녔다면 다른 하이드로겔들도 Applegate 연구진이 사용한 다광자 마이크로매칭 기법에 충분히 활용될 수 있다.

마지막으로 투영 광경화 수지조형 기반 자유형 3D 프린팅 기법이다. 현재 비교적 보편적으로 사용되는 압출 기반 3D 프린팅 기법들에 비해 광경화 수지조형 기술은 생존 세포들에 추가적인 스트레스를 가하게 되는 외부 압출 압력으로부터 자유롭다. 이 기술은 광중합성 고분자를 이용해 고도로 정교한 구조를 제작하는 데에 널리 사용된다. 투영 광경화 수지조형 기법에서, 특히 DLP 기반 마이크로스케일 연속 광학 바이오프린팅(μCOB)이 고속 및 고해상도로 지지 하이드로겔 내에서 사전 혈관화 된 조직을 형성하기 위해 채택되었다. 이때 설계된 구조가 하이드로겔 내에서 광가교 된 후 형태를 유지할 수 있어야 하므로 사용되는 기본 재료들은 광가교성과 생체적합성을 모두 지녀야 한다. 따라서 연구진은 GM-A(Glycidal Methacrylate-hyaluronic acid)와 합성된 LAP와 혼합된 GelMA를 사용해 의도한 구조물을 제작 하였다. μCOB 이외에도, 생체적합성 하이드로겔 내부에서 다혈관 네트워크 생성에 활용되는 조직공학용 광조형 장치인 SLATE 

(Stereolithography apparatus for tissue engineering) 기법이 자유형 3D 프린팅 기법의 유망 기술로 떠오르고 있다.

4. 자유형 3D 프린팅이 당면한 과제 및 향후 연구 동향

4.1. 자유형 3D 프린팅 기술의 직면 과제

근래의 자유형 3D 프린팅 시스템의 발전에도 불구하고 여전히 해결해야 할 몇 가지 과제가 남아있다 [3-5]. 먼저, 지지 매트릭스의 기계적 물성이다. 지지 매트릭스는 인쇄된 잉크를 잡아주고 프린팅이 진행되는 동안 의도하지 않은 부분으로의 프린팅 진행을 방지하는 역할을 한다. 이때 지지 매트릭스의 저장 탄성률이 인쇄하려는 잉크의 저장 탄성률보다 낮으면 의도된 위치가 아닌 다른 곳으로 잉크가 잘못 출력될 수 있다. 또한, 인쇄 노즐이 지지 매트릭스 사이를 자유롭게 움직일 수 있을 정도로 지지 매트릭스의 항복 응력이 낮아야 프린팅이 정상적으로 진행되기 때문에 이에 따라 지지 매트릭스의 기계적 물성을 고려한 선택이 중요하다.

다음으로 제시되는 문제로는 인쇄 속도가 있다. 자유형 3D 프린팅에서의 인쇄 속도는 전체 인쇄 시간과 더불어 인쇄된 잉크의 선과 너비의 품질까지 결정하는 요인이다. 노즐의 이동 속도가 증가할수록 잉크 계면과 지지 매트리스의 계면 간에서의 응력이 비례하여 발생하므로 출력된 잉크의 두께는 얇아진다. 따라서 노즐의 이동 속도 및 인쇄 속도의 조절이 자유형 3D 프린팅 방식에서는 중요하게 다뤄져야 하는 변수이다. 마지막으로 인쇄된 관형 구조의 단면 형태를 조절하기가 어렵다는 점이 제시된다. 인간 혈관 단면은 일반적으로 둥근 형상을 가지지만, 형태학적으로 이와 다른 단면 구조를 갖는 혈관이 보고되기도 한다. 그러므로 인간 혈관을 정확하게 모방하기 위해서는 단면 형태를 조절하는 것역시 앞으로 해결해야 할 과제로 꼽힌다.

4.2. 자유형 3D 프린팅 기술의 미래

3D 프린팅을 통해 제작된 인공 장기 등에 있어서 혈관화 구조는 생활세포 폐기물의 제거, 산소 및 영양소 공급을 위해 필수적인 요소이다. 특히나 심장과 같이 높은 수준의 산소량을 필요로 하는 조직은 신체에 적용 가능한 혈관의 형성이 매우 중요한데, 이러한 점에 있어서 3D 프린팅 기술이 혈관 네트워크의 생체 가공에 기여한다 해도 아직 원래의 혈관처럼 기능하는 통기성 관상구조를 3D 프린팅하는 것에 관한 문제가 남아있다. 이 문제를 해결하기 위해서 기계학습을 통해 바이오잉크의 형태 정확성이나 해상도, 생체적합성을 결정하고 최적의 조건을 계산하는 방안과, 높은 해상도로 미세 단위의 혈관 구조를 인쇄하기 위한 2광자 중합 방식(2PP; two photon polymerization), 그리고 현재의 방식들보다 더 높은 생체모방성을 띠는 4D 프린팅 방식이 언급되고 있다. 아직까지 혈관 구조를 지닌 인공 조직을 제작하는 연구는 초기 단계에 머물러 있지만, 3D 프린팅 공정의 빠른 발전에 의해 머지않아 임상 단계에 적용할 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 국내에서도 관련분야 연구자와 의료기기 회사들의 노력으로 상용화에 박차를 가하고 있으며, 곧 그 결실이 얻어질 것으로 기대된다.